本發(fā)明涉及一種來源于居海藻黃桿菌的寬溫域低溫β-半乳糖苷酶ouc-jst及其編碼基因與應(yīng)用，屬于功能酶。
背景技術(shù)：
1、公開該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的一些理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。
2、乳糖廣泛存在于各類奶制品中。乳糖一方面可以在降解后為人體提供能量，另一方面可以促進(jìn)小腸內(nèi)雙歧桿菌等有益細(xì)菌的生長。但患有乳糖不耐癥的人群會因腸道中乳糖過多積累導(dǎo)致腹瀉、腸胃脹氣和痙攣，從而引發(fā)組織脫水和鈣吸收減少。乳糖不耐癥是由體內(nèi)缺乏半乳糖苷酶導(dǎo)致。乳糖不耐癥患者在亞洲占70%以上，而在非洲部分國家高達(dá)90%~100%。
3、目前，應(yīng)用最廣泛的解決乳糖不耐癥的方法是通過β-半乳糖苷酶水解乳糖從而使得乳制品達(dá)到無乳糖或低乳糖的狀態(tài)。商業(yè)化β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度主要集中在35~65℃。但是，在乳制品生產(chǎn)工業(yè)中，很多操作工藝都是在低溫下進(jìn)行。因此，需要更多在低溫條件下仍能表現(xiàn)出較高的酶活的β-半乳糖苷酶。
4、現(xiàn)有技術(shù)中已報(bào)道了一些低溫β-半乳糖苷酶，例如來源于交替單胞菌屬( alteromonas?sp.)、喜冷桿菌種( alkalilactibacillus?ikkense)等的適冷酶。然而，這些酶的溫度-活性譜存在差異，且其在實(shí)際生產(chǎn)條件下的應(yīng)用效果仍有提升空間。此外，同一菌株中可能存在多個(gè)預(yù)測的β-半乳糖苷酶基因，但并非所有預(yù)測序列都能成功表達(dá)出有活性的酶，這增加了新酶開發(fā)的不可預(yù)測性。
5、針對上述問題和現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明從居海藻黃桿菌( flavobacterium?algicola)中篩選出一種具有獨(dú)特寬溫域特性的β-半乳糖苷酶ouc-jst，并探究其對乳糖的水解效果，以期為緩解乳糖不耐癥提供新的酶制劑選擇。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種來源于居海藻黃桿菌( flavobacterium?algicola)的寬溫域低溫β-半乳糖苷酶ouc-jst。
2、本發(fā)明的目的還在于提供編碼所述β-半乳糖苷酶ouc-jst的基因。
3、本發(fā)明的目的還在于提供包含所述基因的重組表達(dá)載體和重組工程菌。
4、本發(fā)明的目的還在于提供所述β-半乳糖苷酶ouc-jst的制備方法。
5、本發(fā)明的目的還在于提供所述β-半乳糖苷酶ouc-jst在低溫下水解乳糖的應(yīng)用。
6、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
7、本發(fā)明的第一方面，提供一種β-半乳糖苷酶ouc-jst，所述β-半乳糖苷酶ouc-jst具有seq?id?no.1所示的氨基酸序列，并且具有以下溫度-活性特性：
8、(a)?最適反應(yīng)溫度為20℃；
9、(b)?在5℃至30℃的溫度范圍內(nèi)，相對酶活不低于50%；
10、(c)?在0℃時(shí)，相對酶活不低于20%。
11、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述β-半乳糖苷酶ouc-jst來源于居海藻黃桿菌( flavobacterium?algicola)，且其相對分子質(zhì)量為121.3?kda。
12、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述β-半乳糖苷酶ouc-jst在4℃保存200?h后殘留酶活不低于50%。
13、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述β-半乳糖苷酶ouc-jst在10℃牛乳中，以1?u/ml的加酶量處理12小時(shí)，乳糖水解率不低于89%。
14、在本發(fā)明的第二方面，提供編碼第一方面所述β-半乳糖苷酶ouc-jst的基因。
15、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
16、在本發(fā)明的第三方面，提供含有第二方面所述基因的重組表達(dá)載體。
17、優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為pet28a-ouc-jst，是將seq?id?no.2所示基因克隆至pet-28a(+)載體的多克隆位點(diǎn)而得。
18、在本發(fā)明第四方面，提供含有第三方面所述重組表達(dá)載體的重組工程菌。
19、優(yōu)選地，所述重組工程菌為大腸桿菌bl21(de3)/pet28a-ouc-jst，是將pet28a-ouc-jst轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中而得。
20、在本發(fā)明第五方面，提供一種制備所述β-半乳糖苷酶ouc-jst的方法，包括以下步驟：
21、(1)?構(gòu)建含有第二方面所述基因的重組表達(dá)載體；
22、(2)?將步驟(1)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，得到重組工程菌；
23、(3)?培養(yǎng)所述重組工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)β-半乳糖苷酶ouc-jst；
24、(4)?純化步驟(3)表達(dá)的β-半乳糖苷酶ouc-jst。
25、優(yōu)選地，步驟(3)中所述誘導(dǎo)的條件為：在od600值為0.8時(shí)，加入終濃度為0.1?mm的iptg，在37℃、220?rpm條件下誘導(dǎo)20小時(shí)。
26、優(yōu)選地，步驟(4)中所述純化包括：超聲破碎菌體，離心收集上清液，然后使用ni-nta柱進(jìn)行親和層析純化。
27、在本發(fā)明第六方面，提供第一方面所述β-半乳糖苷酶ouc-jst在低溫下水解乳糖中的應(yīng)用。
28、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用是將β-半乳糖苷酶ouc-jst加入至待處理的乳制品中，在低溫條件下進(jìn)行水解反應(yīng)。
29、更進(jìn)一步地，所述低溫條件為0-30℃，優(yōu)選為10-20℃，最優(yōu)選為20℃。
30、更進(jìn)一步地，所述乳制品為牛乳。
31、與本發(fā)明人知曉的相關(guān)技術(shù)相比，本發(fā)明其中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下有益效果：
32、（1）提供了全新的酶資源，且該酶具有序列不可替代性
33、本發(fā)明首次從居海藻黃桿菌( flavobacterium?algicola)中分離獲得β-半乳糖苷酶ouc-jst。更重要的是，本發(fā)明人基于該菌株基因組信息預(yù)測了多個(gè)候選基因，但在相同的表達(dá)和檢測條件下，僅有seq?id?no.2所示的基因能夠成功表達(dá)出具有明顯酶活性的可溶性蛋白，其余候選基因均未檢測到有效酶活。這一結(jié)果證實(shí)，seq?id?no.1所示的氨基酸序列是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的、具有實(shí)際酶活性的特定序列，其活性并非該類酶的普遍特征，而是本發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)篩選獲得的意外發(fā)現(xiàn)。這種“從眾多候選中篩選出唯一活性序列”本身即體現(xiàn)了本發(fā)明的創(chuàng)造性。
34、（2）獨(dú)特的寬溫域低溫適應(yīng)性
35、本發(fā)明提供的ouc-jst具有優(yōu)異的低溫適應(yīng)性和寬溫度活性范圍：
36、最適反應(yīng)溫度為20℃，屬于典型的低溫酶，適合乳制品低溫加工工藝；
37、寬溫度活性范圍：在5℃至30℃的廣泛溫度范圍內(nèi)，相對酶活均能保持在最高酶活的50%以上；
38、超低溫活性：在0℃時(shí)仍能保留20%的酶活。
39、這種低溫高活性+寬適溫范圍的組合特性，使其能夠更好地適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的溫度波動(dòng)（如冷鏈運(yùn)輸中的溫度變化、不同季節(jié)的生產(chǎn)條件差異等），具有顯著的實(shí)用價(jià)值?，F(xiàn)有技術(shù)中未見教導(dǎo)或暗示gh2家族適冷酶必然具有這樣的寬溫域特性。
40、（3）良好的貯藏穩(wěn)定性
41、ouc-jst在4℃下保存200?h后仍可保留初始酶活的50%以上，有利于酶制劑的運(yùn)輸和儲存，降低了工業(yè)應(yīng)用中的冷鏈成本。
42、（4）優(yōu)異的實(shí)際應(yīng)用效果
43、以乳糖為底物測定，ouc-jst的比酶活為2.59?u/mg。在10℃牛乳中，以1?u/ml的加酶量處理：12小時(shí)：乳糖水解率達(dá)到89.64%；48小時(shí)：乳糖水解率超過96%。這一數(shù)據(jù)證明，該酶不僅具有溫度適應(yīng)性，更能直接應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)場景，有效解決乳糖不耐癥人群的需求。這種“從實(shí)驗(yàn)室到應(yīng)用”的完整驗(yàn)證，是本技術(shù)對現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)質(zhì)貢獻(xiàn)。
44、（5）為蛋白質(zhì)工程提供優(yōu)良骨架
45、本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，ouc-jst的蛋白骨架具有良好的結(jié)構(gòu)可塑性，為進(jìn)一步的分子改造奠定了基礎(chǔ)。這一特性使其不僅具有直接應(yīng)用價(jià)值，更具有作為蛋白質(zhì)工程改造平臺的潛力。